TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO DƯỢC LIỆU DIỆP HẠ CHÂU

2. PHƯƠNG PHÁP THỬ:

2.1 Tính chất

- Bằng cảm quan, phải đạt các yêu cầu đã nêu.

2.2 Định tính

A.  Phản ứng hóa học

Thiết bị

• Dụng cụ đun hồi lưu
• Bình nón nút mài 100 ml

Thuốc thử

• Acid hydrocloric (TT)
• Bột magnesi (TT)
• Sắt (III) clorid 9% (TT)
• Dung dịch gelatin 1% (TT)
• Ethanol 90% (TT)                                       

Cách tiến hành:

a) Lấy 0,5 g chế phẩm, thêm 50 ml ethanol 90% (TT), lắc đều, đun hồi lưu trong cách thuỷ 30 phút. Lọc, bay hơi dịch lọc trên cách thủy còn 10 ml, chuyển vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml để làm các phản ứng sau đây:

Ống 1: Thêm 4 - 5 giọt acid hydrocloric (TT) rồi thêm tiếp một ít bột magnesi (TT), xuất hiện màu đỏ.

Ống 2: Thêm 3 - 4 giọt dung dịch sắt (III) clorid 9% (TT), xuất hiện màu xanh tím.

b) Lấy 0,1 g chế phẩm, thêm 5 ml nước, đun sôi trong vài phút rồi lọc. Để nguội, lấy 2 ml dịch lọc thêm 2 - 3 giọt dung dịch gelatin 1% (TT), xuất hiện tủa bông trắng.

B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

Thiết bị

-   Cân kĩ thuật

-   Bình nón nút mài 100 ml

-   Bản mỏng Silicagel 60F₂₅₄

-   Đèn UV bước sóng 366 nm

Thuốc thử

• Cloroform (TT)
• Amoniac (TT)
• Dragendorff (TT)                                        
• Lá diệp hạ châu đắng (DLĐC)
• Dung môi khai triển: Cloroform – methanol (7 : 3)

Dung dịch thử:

Lấy 0,5 g chế phẩm, hòa tan trong 20 ml nước nóng, để nguội, kiềm hóa bằng amoniac (TT) đến pH 9 – 10, lắc dung dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thủy đến còn khoảng 2 ml, dùng làm dung dịch thử.

Dung dịch đối chiếu:

Lấy 5 g Diệp hạ châu đắng (mẫu chuẩn) thêm 100 ml nước, đun sôi nhẹ trong 30 phút, để nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến còn 20 ml, để nguội, kiềm hóa bằng amoniac (TT) đến pH 9 – 10, lắc dung dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thủy đến còn khoảng 2 ml, dùng làm dung dịch đối chiếu.

Cách tiến hành:

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 20 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ngoài không khí rồi phun thuốc thử Dragendorff (TT). Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường. Sắc kí đồ dung dịch thử phải có vết cùng giá trị R_f  và màu sắc với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu.

C. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

Thiết bị

-   Cân kĩ thuật

-   Bình nón nút mài 100 ml

-   Bản mỏng Silicagel GF₂₅₄

-   Đèn UV bước sóng 366 nm

Thuốc thử

• Cloroform (TT)                                              
• Ethanol (TT)                                                   
• Acid sulfuric 10% (TT)
• Lá diệp hạ châu đắng (DLĐC)
• Phyllanthin chuẩn (CĐC)
• Dung môi khai triển: n-Hexan – ethyl acetat (2 : 1)

Dung dịch thử:

Lấy 0,4 g chế phẩm, hòa tan trong 20 ml nước nóng, để nguội, lắc kĩ dung dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml ethanol (TT), dùng làm dung dịch thử.

Dung dịch chất đối chiếu:

Hòa tan phyllanthin chuẩn trong ethanol (TT) để được dung dịch đối chiếu có nồng độ khoảng 2 mg/ml.

Dung dịch dược liệu đối chiếu:

Lấy 4 g Diệp hạ châu đắng đã cắt nhỏ (mẫu chuẩn), thêm 100 ml nước, đun sôi nhẹ trong 30 phút, để nguội, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến còn 20 ml, để nguội, lắc dịch thu được với cloroform (TT) 2 lần, mỗi lần 20 ml. Gộp các dịch chiết cloroform, bay hơi trên cách thủy đến cắn, hòa tan cắn trong 1 ml ethanol (TT).

Cách tiến hành:

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10% (TT), sấy bản mỏng ở 120 ^oC đến khi hiện rõ vết. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm. Sắc kí đồ dung dịch thử phải có vết cùng giá trị R_f  và màu sắc với vết của phyllanthin trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu và có các vết cùng màu sắc, giá trị R_f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu.

2.3 Mất khối lượng do làm khô

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6 (1g chế phẩm , 85^oC, 5 h).

2.4 Tro toàn phần

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8

2.5 Tro không tan trong acid hydroclorid

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.7

2.6 Cắn không tan trong ethanol

Cân 1,0 g chế phẩm trong cốc 100 ml, thêm 50 ml ethanol 50%, đun cách thủy và khuấy tan chế phẩm.

Lọc qua giấy lọc đã cân bì, rửa cắn và giấy lọc bằng nước cất cho tới khi nước rửa không màu, sấy cắn và giấy lọc ở 100 ^oC đến 105 ^oC trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút, cân nhanh để xác định khối lượng cắn.

2.7 pH

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 6.2

2.8 Kim loại nặng

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.4.8, phương pháp 3, sử dụng 1g chế phẩm và 2ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT).

2.9 Định lượng

Phương pháp sắc kí lỏng (Phụ lục 5.3)

Thiết bị

• Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1100 (Agilent) với đầu dò DAD.
• Cột sắc ký: Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) của Agilent.
• Cân phân tích Sartorius.
• Bể siêu âm.
• Màng lọc Sartorius RC (regenerated cellulose) - Vliesverstaerkr 0,45 µm (Sartorius, Đức)
• Hệ thống lọc pha động dưới áp suất thấp.
• SPE: ProElut C18 (500mg/6ml) của Dikma.

•  Một số dụng cụ thủy tinh chính xác khác.

Thuốc thử

• Nước cất loại dùng cho HPLC (TT)    
• Acid phosphoric loại dùng cho HPLC (TT)
• Methanol loại dùng cho HPLC (TT)   
• Phyllanthin chuẩn (CĐC)

Dung dịch chuẩn:

Hòa tan phyllanthin chuẩn trong methano1 90% (TT) để được dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 30 µg/ml.

Dung dịch thử:

Cân chính xác khoảng 0,4 g chế phẩm đã xác định độ ẩm vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm 5 ml nước, lắc kĩ để phân tán đều. Thêm 30,0 ml methanol (TT), siêu âm trong 30 phút. Để nguội, bổ sung methanol (TT) vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Xử lý mẫu thử qua SPE:

Điều kiện sắc kí   

   Column                     :  Zorbax-C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) của Agilent

   Detector                    :  quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm.

   Tốc độ dòng             : 1,0 ml/phút.

   Thể tích tiêm mẫu   :  20 µl

   Pha động A               : Methanol

   Pha động B               : Dung dịch acid phosphoric 0,03%

Cách pha dung dịch acid phosphoric 0,03% : Hút chính xác 0,3 ml acid phosphoric loại phân tích pha trong 900ml nước cất. Bổ sung nước vừa đủ 1000ml. Lọc qua màng lọc 0,45 m.

Cách tiến hành:

Tiến hành sắc kí theo chương trình dung môi sau đây

Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi sắc kí đồ. Tính hàm lượng phyllanthin trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng chuẩn.

Hàm lượng phyllanthin (C₂₄H₃₄O₆) trong chế phẩm không được ít hơn 0,7 % tính theo chế phẩm khô kiệt.

Công thức tính:

Trong đó:

            S_T : diện tích pic của dung dịch thử.

S_C : diện tích pic của dung dịch chuẩn.

m_T: Khối lượng cân (g) mẫu thử.

m_C: Khối lượng cân (g) mẫu chuẩn.

dfl_T: độ pha loãng của mẫu thử.

dfl_C: độ pha loãng của mẫu chuẩn..

C%: Hàm lượng chuẩn

2.10 Giới hạn nhiễm khuẩn

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 13.6

3. ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN:

• Sản phẩm đóng trong bao bì kín.
• Nhãn rõ ràng, đúng quy chế.
• Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát.
• Hạn dùng: 24 tháng kể từ khi sản xuất.