TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CÀNH VÀ LÁ DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG

1. YÊU CẦU KỸ THUẬT:

2. PHƯƠNG PHÁP THỬ:

2.1 Bộ phận dùng

Cành và lá đã phơi hay sấy khô của cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum. et Thonn.), họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).

2.2 Mô tả

Những đoạn cành dài 2 - 5 cm, màu xanh nhạt. Phiến lá hình bầu dục, dài từ 5 - 10 mm, rộng 3 - 6 mm, màu xanh sẫm ở mặt trên, màu xanh nhạt ở mặt dưới. Quả nang, nhẵn, hình cầu, đường kính 1.8 mm đến 2 mm. có đài tồn tại.

2.3 Vi phẫu

Gân lá: Gân giữa mặt dưới lồi rõ, mặt trên gần như phẳng, biểu bì trên là một lớp tế bào hình chữ nhật và gần đều nhau, lớp cutin mỏng có răng cưa rất nhỏ. Mô dày tròn ít rõ. Dưới mô dày có một lớp tế bào mô giậu. Mô mềm gồm những tế bào hình tròn, xếp chừa những khe nhỏ. Libe và gỗ cấu tạo cấp 1 xếp thành hình cung, gỗ ở trên, libe ở dưới. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai trong một vài mô mềm ngay dưới libe.

Phiến lá: Biểu bì trên là những tế bào hình bầu dục không đều nhau, lớp cutin mỏng, có răng cưa rất nông. Tế bào biểu bì dưới có hình chữ nhật nằm ngang hơi dẹt hơn tế bào biểu bì trên. Lỗ khí có nhiều ở biểu bì dưới và ít hơn ở biểu bì trên, lỗ khí kiểu hỗn bào hay dị bào, ít song bào với 2 tế bào bạn không đều nhau. Chỉ số lỗ khí X≥ 20. Mô mềm giậu là một lớp tế bào, chiếm gần nửa chiều dày phiến lá. Mô mềm khuyết gồm những tế bào không đều, vách uốn lượn nhiều, xếp chừa những khuyết to. Một vài tinh thể calci oxalat hình lăng trụ trong mô mềm giậu.

2.4 Bột

Bột màu xanh, vị rất đắng.

Mảnh biểu bì mang lỗ khí, bó sợi dài, mảnh mô mềm tế bào đa giác, thành mỏng, mảnh mạch vạch, mạch xoắn.

2.5 Định tính

A.  Phản ứng hóa học

Thiết bị

• Dụng cụ đun hồi lưu
• Bình nón nút mài 100 ml

Thuốc thử

• Acid hydrocloric (TT)
• Bột magnesi (TT)
• Sắt (III) clorid 9% (TT)
• Dung dịch gelatin 1% (TT)
• Ethanol 90% (TT)                                       

Cách tiến hành:

a) Lấy 5 g dược liệu, tán nhỏ, thêm 50 ml ethanol 90% (TT), lắc đều, đun hồi lưu trong cách thuỷ 30 phút. Lọc, cô cách thủy còn 10 ml, để nguội, chuyển vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml để làm các phản ứng sau đây:

Ống 1: Thêm 4 - 5 giọt acid hydrocloric (TT) rồi thêm tiếp một ít bột magnesi (TT), xuất hiện màu đỏ.

Ống 2: Thêm 3 - 4 giọt dung dịch sắt (III) clorid 9% (TT), xuất hiện màu xanh tím.

b) Lấy 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước, đun sôi trong vài phút rồi lọc. Lấy 2 ml dịch lọc đã nguội thêm 2 - 3 giọt dung dịch gelatin 1% (TT), xuất hiện tủa bông trắng.

B. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4)

Thiết bị

-   Cân kĩ thuật

-   Bình nón nút mài 100 ml

-   Bản mỏng Silicagel GF₂₅₄

-   Đèn UV bước sóng 366 nm

Thuốc thử

• Cloroform (TT)                                            
• Ethanol (TT)                                                
• Acid sulfuric 10% (TT)
• Lá diệp hạ châu đắng (DLĐC)
• Phyllanthin chuẩn (CĐC)
• Dung môi khai triển: n-Hexan – ethyl acetat (2 : 1)

Dung dịch thử:

Lấy 4 g bột dược liệu vào bình nón nút mài, thêm 25 ml cloroform (TT), lắc siêu âm 15 phút, lọc. Cô dịch lọc trên cách thủy đến cạn. Hòa cắn trong 1 ml ethanol (TT) được dung dịch chấm sắc ký.

Dung dịch chất đối chiếu:

Hòa tan phyllanthin chuẩn trong ethanol (TT) để được dung dịch đối chiếu có nồng độ khoảng 2 mg/ml.

Dung dịch dược liệu đối chiếu:

Lấy 4 g bột Diệp hạ châu đắng (mẫu chuẩn), tiến hành chiết như mô tả ở phân Dung dịch thử.

Cách tiến hành:

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10 µl mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra để khô ở nhiệt độ phòng, phun dung dịch acid sulfuric 10% (TT), sấy bản mỏng ở 120 ^oC đến khi hiện rõ vết. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường hoặc dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm. Sắc kí đồ dung dịch thử phải có vết cùng giá trị R_f  và màu sắc với vết của phyllanthin trên sắc ký đồ của dung dịch chất đối chiếu và có các vết cùng màu sắc, giá trị R_f với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch dược liệu đối chiếu.

2.6 Độ ẩm

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.6 (1g chế phẩm , 105^oC, 4h).

2.7 Tro toàn phần

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 9.8

2.8 Tỷ lệ vụn nát

- Thử theo DĐVN V, phụ lục 12.12

2.9 Chất chiết được trong dược liệu

- Tiến hành theo phương pháp chiết nóng (phụ lục 12.10), dùng ethanol 96 % (TT) làm dung môi.

2.10 Định lượng

Phương pháp sắc kí lỏng (Phụ lục 5.3)

Thiết bị

• Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HP 1100 (Agilent) với đầu dò DAD.
• Cột sắc ký: Zorbax Eclipse XDB-C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) của Agilent.
• Cân phân tích Sartorius.
• Bể siêu âm.
• Màng lọc Sartorius RC (regenerated cellulose) - Vliesverstaerkr 0,45 µm (Sartorius, Đức)
• Hệ thống lọc pha động dưới áp suất thấp.
• SPE: ProElut C18 (500mg/6ml) của Dikma.
• Một số dụng cụ thủy tinh chính xác khác.

Thuốc thử

• Nước cất loại dùng cho HPLC (TT)    
• Acid phosphoric loại dùng cho HPLC (TT)
• Methanol loại dùng cho HPLC (TT)   
• Phyllanthin chuẩn (CĐC)

Dung dịch chuẩn:

Hòa tan phyllanthin chuẩn trong methano1 90% (TT) để được dung dịch chuẩn có nồng độ chính xác khoảng 30 µg/ml.

Dung dịch thử:

Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu (qua rây số 355) vào bình nón nút mài có dung tích 100 ml, thêm chính xác 20,0 ml methano1 90% (TT), đậy nắp, cân xác định khối lượng. Lắc siêu âm trong 30 phút, để nguội, cân lại và bổ sung khối lượng mất đi bằng methano1 90% (TT), lắc đều, lọc qua giấy lọc, bỏ 5 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1,0 ml dịch lọc sau vào bình định mức 25 ml, thêm methano1 90% (TT) đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm.

Xử lý mẫu thử qua SPE:

Điều kiện sắc kí   

   Column                     : Zorbax-C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm) của Agilent

   Detector                    : quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 230 nm.

   Tốc độ dòng             : 1,0 ml/phút.    Nhiệt độ cột:  40^oC.      Thể tích tiêm mẫu   :  20 µl.

   Pha động A               : Methanol

   Pha động B               : Dung dịch acid phosphoric 0,03%

Cách pha dung dịch acid phosphoric 0,03% : Hút chính xác 0,3 ml acid phosphoric loại phân tích pha trong 900ml nước cất. Bổ sung nước vừa đủ 1000ml. Lọc qua màng lọc 0,45μm.

Cách tiến hành:

Tiến hành sắc kí theo chương trình dung môi sau đây

Tiêm lần lượt dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi sắc kí đồ. Tính hàm lượng phyllanthin trong chế phẩm dựa vào diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và hàm lượng C₂₄H₃₄O₆ trong phyllanthin chuẩn.

Hàm lượng phyllanthin (C₂₄H₃₄O₆) trong chế phẩm không được ít hơn 0,05 % tính theo chế phẩm khô kiệt.

Công thức tính:

Trong đó:

            S_T : diện tích pic của dung dịch thử.

S_C : diện tích pic của dung dịch chuẩn.

m_T: Khối lượng cân (g) mẫu thử.

m_C: Khối lượng cân (g) mẫu chuẩn.

dfl_T: độ pha loãng của mẫu thử.

dfl_C: độ pha loãng của mẫu chuẩn.

C%: Hàm lượng chuẩn.

3. ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN:

• Sản phẩm đóng trong bao bì kín.
• Nhãn rõ ràng, đúng quy chế.
• Bảo quản nơi khô ráo, thoáng mát.
• Hạn dùng: 24 tháng kể từ khi sản xuất.